复旦大学王瑞：如何让CRISPR检测“更快、更高、更强”？

在临床样本检测实践中，我们发现传统方法在灵敏度、特异性、检测周期和成本等方面均存在明显不足。

针对这些问题，我们致力于开发新型CRISPR检测方法，旨在显著提升检测性能，同时简化操作流程。此外，我们还开发了配套的微流控设备，将方法与装备有机结合，推动POCT分子诊断的实际应用。

本团队的研究特色在于：紧密追踪技术前沿，立足实际需求，通过持续的技术创新，实现从定性到定量、从实验室研究到POCT应用的完整技术转化。

正如王金老师所述，CRISPR技术正在引领下一代分子诊断的发展。

众多顶尖学者，包括张锋教授等，已发表大量CRISPR相关研究成果，这些新兴的CRISPR工具被誉为下一代分子诊断技术的代表。

CRISPR技术具有无可比拟的优势：其最突出的特点是极高的分辨率和特异性。与PCR技术相比，传统PCR在检测单碱基突变时存在明显局限，而CRISPR系统能够精准识别单个碱基的差异。

形象地说，若将PCR比作放大镜，CRISPR则相当于显微镜，特别适用于SNP位点的高特异性检测。

在产业化方面，国际国内均已取得显著进展。张锋教授等已创立相关企业，我国王金老师创立的吐露港生物也表现突出。

面对广阔的市场前景，我们需要深入思考CRISPR技术从科研到产业化过程中面临的关键挑战。

主要包括三个方面：

• 首先是CRISPR-Cas系统的专利布局问题，需要开发更多新型Cas酶以构建自主专利池；

• 其次是现有检测方法的便捷性优化，确保非专业人员能够轻松操作；

• 最后是配套设备的开发，解决技术应用的"最后一公里"问题。

针对这些挑战，我们的研究重点明确：

• 一是开发新型CRISPR-Cas工具；

• 二是构建更简便的检测方法；

• 三是研制配套设备，推动家用和基层检测应用。

在新型工具开发方面，随着AI技术的发展，Cas酶的改造与优化仍处于快速发展阶段，存在广阔的探索空间。通过开发新型Cas酶，我们将获得独特的技术优势。

CRISPR系统可分为多亚基和单亚基两类。

考虑到工具的易用性，我们优先选择开发单亚基系统，如Cas9、Cas12和Cas13系列，致力于将其转化为高效实用的分子诊断工具。

开发新型Cas酶的主要动因在于现有系统存在若干关键性局限。

• 首先，PAM序列限制显著制约了CRISPR技术的应用范围。

  Cas9依赖NGG PAM序列，Cas12系列需要TTTN等PAM序列，而Cas13虽然无需PAM序列但仅适用于RNA检测。

  我们致力于开发不受PAM序列限制的新型酶，以实现任意核酸序列和SNP位点的自由检测，从而大幅拓展CRISPR技术的应用场景。

• 其次，现有Cas酶与扩增技术的兼容性不足。

  当前检测流程需要先进行扩增再转入CRISPR检测体系，这种分离操作不利于开发简便的检测方法。

  我们计划开发具有良好温度耐受性和强兼容性的新型Cas酶，实现扩增与检测的一体化操作。

• 第三，专利壁垒问题亟待解决。

  为突破国外技术封锁，我们亟需自主开发和改造Cas酶，构建自主知识产权体系，为后续产品开发奠定基础。

Cas酶系统的工作原理本质上需要三个核心元件：具有切割活性的Cas酶、定位作用的PAM序列以及连接靶标与Cas酶的向导RNA。

开发新型Cas酶的关键在于识别这三个元件的优化组合。

在开发策略上，团队从DNA修复机制中获得重要启示。细胞在DNA双链断裂后主要通过快速拼接方式进行修复，这一过程中常伴随碱基的增加或缺失。

基于此原理，团队设计了新型Cas酶开发方案。

在Cas酶改造方面，团队开发了Cas蛋白定向进化系统和Cas酶定点改造方法。

此外，为拓展PAM序列的应用范围，团队建立了体外PAM序列全方位评估系统。

以上方法为团队自主开发和改造Cas酶，拓展Cas酶的靶向和检测范围奠定了基础，极大提升了CRISPR系统的检测效率。

在CRISPR检测方法开发方面，我们以"更快、更高、更强"的奥林匹克精神为指导持续创新。

• "更快"体现在检测速度的突破，目标实现10分钟内完成检测；

• "更高"追求检测性能的提升，包括灵敏度和特异性的优化；

• "更强"则致力于方法的简便性和普及性，使其适用于基层和家庭场景。

自2017年张锋和Doudna首次报道CRISPR体外诊断方法以来，我们持续进行技术迭代。

从最初的两步法发展到一步法，从多管操作优化为一管化反应，从单重检测扩展到多重检测，将检测时间从2小时缩短至10分钟。

这些方法已成功应用于病原体感染检测、耐药性分析、癌症热点突变筛查、伴随诊断和遗传病筛查等多个领域。

1、让检测速度“更快”

我们早期开发的30分钟一体化检测方法已较为成熟，通过将RPA扩增与CRISPR检测整合在一管中，肉眼即可判读结果，该成果已成为高被引论文。

在此基础上，我们进一步开发了10分钟快速检测方法，持续推动CRISPR诊断技术的创新发展。

在快速PCR技术开发方面，我们实现了3min内完成扩增反应的技术突破。

这一突破主要依赖于优化的热传导系统，能够快速实现95℃的变性和60℃的退火延伸过程。扩增产物随后与CRISPR系统结合，通过切割反应实现可视化检测。

为进一步提升检测能力，我们开发了多重病原体同步检测技术。

该技术采用分子信标方法结合快速PCR扩增，通过设计三种不同标记的分子信标分别识别三种靶标分子。分子信标本身为茎环结构，荧光基团与淬灭基团相邻时荧光被淬灭。当与靶标结合后，茎环结构打开，荧光信号释放。

这种方法实现了三种病原体的同步检测和肉眼区分。

2、让检测性能“更高”

在检测灵敏度提升方面，我们开发了基于LAMP扩增与CRISPR结合的高灵敏度检测方法。

该方法通过两重信号放大机制实现单分子水平的检测：第一重放大来自LAMP扩增，第二重放大来自CRISPR系统的报告分子切割。这种双重放大机制显著提高了检测灵敏度，相关成果已成为高被引论文。

一体化检测方法的开发是另一重要突破。

我们将恒温扩增与CRISPR检测整合在单一反应体系中，操作简便，仅需加入样本后等待10-30min即可肉眼判读结果。这种方法不仅简化了操作流程，还实现了定量检测能力，解决了CRISPR医学应用中的关键痛点。

在检测特异性研究方面，我们系统探究了Cas酶和gRNA的特性。

研究发现不同Cas酶的特异性区域存在差异：Cas12a在PAM近端有特异性，Cas12b在PAM远端有特异性，而Cas14则在中间区域表现出特异性。同时发现gRNA长度对特异性有重要影响，较短的gRNA可提高特异性，但过短会影响活性。

基于这些发现，我们开发了CRISPR多重SNP检测系统。

该系统采用逻辑判断方式，通过三管反应同时检测三种突变（如Omicron和Delta变异株），结合感染状态判断，实现了新冠病毒变异株的精准分型。这一技术为疫情防控提供了重要的检测工具。

在癌症热点突变检测方面，我们开发了一种名为SPEAR的方法。

该方法将NEAR扩增技术与Cas12b系统相结合，成功应用于白血病和胰腺癌的早期筛查。该方法展现出卓越的检测灵敏度，能够检出0.1%的低频突变。这种高灵敏度检测能力为癌症早期诊断提供了重要技术支持。

与常规测序技术相比，该方法性能显著优于一代测序（仅能检测5-10%以上的突变），与二代测序的检测灵敏度相当，展现出良好的临床应用价值。

该方法还可以识别耐药突变的发生，为临床用药调整提供依据。因此所开发的SPEAR方法在癌症早筛和伴随诊断中展现出巨大应用前景。

3、让检测便捷性“更强”

在病原体检测方面，我们开发了名为SATCAS的创新方法。

该方法特异性扩增RNA而不扩增DNA，无需预先降解DNA，可直接用于样本检测。这一特性使其能够有效区分死活菌，并评估病原体在宿主体内的活跃程度，为临床干预提供参考。

针对PAM序列限制问题，我们采用Cas14系统结合快速扩增技术，开发了无需PAM序列的检测方法。

该方法可在10分钟内完成检测，成功应用于幽门螺杆菌的耐药突变检测。幽门螺杆菌作为I类致癌物，其根除治疗面临挑战。该方法不仅能检测感染状态，还能识别耐药突变，为个体化治疗方案制定提供依据。

我们进一步拓展了CRISPR技术的应用范围，实现了非核酸靶标高灵敏检测。

通过适配体将非核酸靶标信号转化为核酸信号，再进行扩增和CRISPR检测，可极大提高灵敏度。

此外，采用单抗或适配体直接捕获细菌的策略，无需裂解提取核酸即可实现单个细菌的检测，极大简化了检测流程。

这些技术创新为CRISPR技术在非核酸检测领域的应用开辟了新途径。

为实现CRISPR技术的临床应用转化，我们开发了液滴数字CRISPR检测方法及配套微流控平台。

该平台能够制备单分散液滴，并实现液滴的精确融合操作。这一技术突破为CRISPR检测的定量化应用提供了关键支持。

我们的方法能够在10分钟内完成检测，并实现每毫升血液中10个CFU的检测灵敏度，充分满足临床手术导航等实时检测需求。

在设备开发方面，我们致力于打造"样本进-结果出"的自动化检测系统。

该系统采用类似洗衣机的操作模式，用户只需将样本放入设备，后续的扩增和检测过程完全自动化，最终通过试纸条直观显示检测结果。

这种设计极大简化了操作流程，特别适合资源有限地区的应用场景。同时，我们开发了配套的在线分析软件，进一步提升用户体验。

总体而言，我们的研究工作涵盖了CRISPR新工具酶开发、检测方法创新和配套设备研制等多个维度。

这些成果已成功应用于人类感染性疾病、基因突变检测以及非核酸检测等多个领域，为下一代分子诊断技术的发展提供了重要支撑。

通过建立通用型CRISPR检测技术平台，包括Cas酶的开发改造、检测方法迭代和配套装备研制，我们实现了高灵敏、高特异且操作便捷的分子诊断解决方案。

在科研转化方面，我们已开发了多项CRISPR检测试剂盒和便携装备，这些成果的科学意义在于发现创新机制、开发新型Cas酶、建立高效特异的检测方法，并通过装备创新促进多场景应用，最终服务于POCT分子诊断需求。