王金博士报告分享《CRISPR诊断技术的研究进展及应用展望》
CRISPR技术最初因CRISPR-Cas9基因编辑功能受到广泛关注，并荣获2020年度诺贝尔化学奖。其应用领域已从基因编辑拓展至诊断领域，形成CRISPR诊断（CRISPR-Dx）技术。
此前，北京、无锡已成功举办两期“CRISPR诊断技术创新与转化”专题会，本文基于第三期专题会内容，系统阐述CRISPR-Dx的核心原理、技术特点、关键难题、标准化建设及应用前景，为该技术的研发与转化提供参考。
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CRISPR-Dx的核心机制是利用Cas蛋白（主要为Cas12/Cas13）的反式切割活性。其基本逻辑如下：
向导RNA可精准引导Cas蛋白识别目标靶标（DNA或RNA）；
Cas蛋白与靶标结合后被激活，释放非特异性的“乱切”活力，能够切割体系中不配对的单链核酸；
该活性可被用于开发报告系统，通过探针切割后的信号释放（如荧光、显色等）实现靶标的检测。
广义上，所有利用CRISPR系统进行靶标核酸或非核酸检测的技术均属于CRISPR诊断，本次聚焦于基于Cas蛋白反式切割活性建立的诊断体系。
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2.1 反应条件简便
无需复杂设备，恒温条件下即可完成反应；
靶标识别具有高度灵活性，仅需设计与靶标互补的向导RNA。
2.2 检测手段多样
CRISPR-Dx可与多种信号输出系统结合，实现灵活检测:
荧光信号检测：通过检测体系荧光强度判断阴阳性；
侧向流层析（试纸条）：通过条带数量判定结果；
电化学检测：基于电化学信号变化实现靶标检测；
显色检测：直接观察体系颜色变化判断结果；
其他：可与拉曼光谱等技术联用拓展检测场景。
2.3 核心技术优势
高灵敏度：结合扩增技术可实现单分子检测，信号可通过探针切割持续放大，假阴性率低，适用于病原检测等场景；
高特异性：可精准识别单碱基差异（SNP），源于CRISPR基因编辑的精准定位能力，假阳性率低，适用于耐药突变、肿瘤筛查、遗传病检测等场景；
低仪器依赖：恒温反应特性降低了对检测设备的要求，为家庭自测等场景提供可能。
2.4技术成熟曲线分析
CRISPR-Dx的发展符合加特纳（Gartner）技术成熟曲线：
技术触发期（2016-2017年）：技术诞生后迅速引发关注，《Science》将其评为“下一代诊断技术”；
期望膨胀期：初期因技术新颖性获得广泛关注，但同时面临质疑（如“PCR可替代”、“操作复杂”、“成本高”、“不定量”等问题）；
幻灭低谷期：经历质疑后，行业逐渐回归理性，技术价值被重新认知；
启蒙斜坡期：当前CRISPR-Dx已接近临床应用水平，技术逐步成熟，类比30年前PCR技术的发展阶段（PCR1983年发明，1995年实现产业化爆发），CRISPR-Dx仍处于发展早期，未来潜力巨大。
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3.1 底层检测系统
已建立基于反式切割活性的核心系统：
基于Cas13的SHERLOCK系统；
基于Cas12的HOLMES系统（吐露港生物王金团队发明）
基于Cas12的DETECTR系统（Jennifer Doudna团队开发）
3.2 一管法（one-tube）/一锅法（one-pot）/一步法（one-step）体系
定义区分：
一管法（one-tube）：封闭管子或芯片内完成反应，可物理分隔，无需开盖；
一锅法（one-pot）：反应物物理混合，可分步反应；
一步法（one-step）：需满足一管、一锅、同步反应；
技术进展：one-pot体系已相对成熟，主流方案包括RPA+Cas12a、RPA+Cas12b、LAMP+Cas12b等，可避免开盖导致的气溶胶污染。
3.3 PAM限制突破
通过Cas蛋白突变体改造、产物单链化等方法，突破CRISPR识别靶标时对PAM序列的依赖，实现任意位点检测。
3.4 多重检测体系
现有进展：2018年张峰团队构建四酶、四gRNA、四种报告的一管四重体系（复杂度高，尚未实际应用）；一管两重体系（Cas12+Cas13）已实现简便应用；
发展方向：攻克单酶多探针多重检测技术，减少体系中蛋白数量，提升检测稳定性与可调节性。
3.5 定量检测技术
技术瓶颈：CRISPR为恒温反应，无PCR的“cycle”概念，相对定量能力弱于PCR；
建议方案：
明确CRISPR具备定量潜力（仅定量精度差异，非不能定量）；
结合数字PCR的微液滴系统，通过泊松分布算法实现绝对定量；
探索Tt值（恒温扩增常用指标）、Ct值（CRISPR-TB方法）、终点法信号值等定量判据。
3.6 免扩增核酸检测技术
核心优势：省试剂、省时间、无气溶胶污染、操作简便，可实现现场分子诊断；
研发方向：
Cas酶级联放大（如Cas12+Cas13协同放大信号）；
多crRNA探针设计（单个靶标匹配多个crRNA，信号倍增）；
与电化学等平台联用，结合Cas突变体优化、反应buffer改良等技术组合。
3.7 非核酸靶标检测
技术原理：通过特定识别系统将非核酸靶标（蛋白、金属离子、代谢物等）的信号转换为Cas蛋白切割活性的调控信号（影响activator靶标核酸、CRISPR复合物或Cas蛋白本身活力）；
技术优势：结合CRISPR的高信号放大能力与免疫检测等方法，显著提升检测灵敏度，有望改变现有免疫诊断格局（包括化学发光市场）；
应用场景：覆盖临床诊断、生命科学、食品科学、环境监测等领域，满足快速、现场检测需求。
3.8 专用仪器与芯片
当前可借助恒温扩增仪器等设备，未来需开发针对CRISPR技术特性的专用仪器及芯片，降低检测门槛。
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4.1 结果判读标准化
现有问题：判读方法多样（荧光强度、胶体金肉眼观察、电化学信号等），缺乏统一标准；
可能方案：
与等温扩增结合的体系：采用Tt值（峰出现时间，值越小靶标浓度越高）；
信号饱和体系：引入At值（角度值，阴性为0°，信号饱和为90°）；
通用判据：终点法（固定时间点信号阈值）、fold change（信号变化倍数，如≥2-3倍为阳性）；
胶体金检测：建立客观判读标准，避免人为误差。
4.2 Cas酶标准化
现存问题：当前科研与产品中Cas蛋白以浓度单位（ng/pmol）计量，导致不同批次、不同厂家产品活力不一致，实验重复性差；
解决方案：
定义活力单位“transU”：37℃、1分钟内切割1pmol探针的酶量；
吐露港生物联合相关单位制定CRISPR诊断领域首个国家标准（2025年立项通过），2026年起提供的Cas蛋白将标注transU活力单位，推动行业统一。
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5.1 核心应用场景
1.个人自测场景：非专业人士可操作、便携式检测（涵盖人及非人应用），需解决气溶胶污染问题；
2.临床核酸检测：针对现有技术检测灵敏度不足的项目（如病原体检测、肿瘤筛查），利用CRISPR高特异性提升检测性能；
3.非核酸检测：应用潜力与核酸检测相当，成为现有免疫技术的有力竞争者；
4.免扩增直检：技术成熟后将引发临床与自测领域的革命性变化，实现快速、无污染的分子诊断。
5.2 发展趋势类比
参考现代化办公设备演变（台式机→笔记本→服务器→智能手机），分子诊断技术呈现“便捷化、移动化”趋势：
PCR（台式机）：开启分子诊断时代，但需分区实验室，操作复杂；
POCT（笔记本）：浓缩PCR核心功能，便携性提升，可灵活移动检测；
NGS（服务器）：解决高通量、大数据检测需求；
CRISPR-Dx（智能手机）：实现个人自测，满足“随时、随地、任何人”的检测需求，未来有很大应用潜力。
5.3 理想居家自测产品特性
安全：使用安全、环境友好（防气溶胶污染，如COMPASS技术）；
简便：支持试纸条或小型仪器，无需专业操作；
快速：检测时间＜20分钟；
经济：价格控制在10-20元；
精准：结合等温扩增与CRISPR技术，兼具高灵敏度与高特异性。
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CRISPR-Dx凭借高灵敏度、高特异性、简便快捷等核心优势，已从技术探索阶段逐步迈向临床转化与产业化应用。当前，行业需聚焦多重检测、免扩增直检、标准化建设等关键技术难题，通过跨领域合作与技术创新突破瓶颈。未来，随着技术成熟与产品迭代，CRISPR-Dx将在个人自测、临床诊断、非核酸检测等领域实现广泛应用，推动分子诊断行业进入“便捷化、大众化”的新时代。吐露港生物将持续以专利授权、原料供应、技术服务为核心，与全球合作伙伴共建CRISPR诊断产业生态，助力技术转化与全球健康问题解决。
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在此简要介绍吐露港生物的发展情况。
公司以"基于CRISPR创新科技解决全球健康威胁"为使命，致力于推动检测技术向更简便的方向发展。ToloBio拥有CRISPR诊断领域的底层专利和方法学专利，并积极构建CRISPR诊断产业生态。作为开放型创新平台，公司秉持合作共赢理念，为行业伙伴提供核心原料和整体解决方案。
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