复旦大学王瑞副研究员报告：《CRISPR分子诊断方法用于多种类生物标志物检测》。
2025年12月21日，由中国医药生物技术协会生物诊断技术分会主办，第三期“生物诊断前沿技术专题会”在复旦大学召开。专题会聚焦《CRISPR诊断技术的创新与转化》。
生物诊断公众号将对各专家汇报内容进行汇编整理，供关注CRISPR诊断技术的业内同仁学习参考。
本期分享复旦大学王瑞副研究员报告：《CRISPR分子诊断方法用于多种类生物标志物检测》。
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人类表型组国际大科学计划旨在通过跨尺度、多维度的表型测量，建立基因-环境-表型之间的关联网络，从而发现指征健康与疾病的生物标志物和新药靶标。本团队的研究聚焦于该计划的“控”环节，即基于发现的生物标志物，开发新型生物诊断方法，以促进精准医疗的转化落地。
CRISPR-Cas系统因其高分辨率、高特异性、可编程性以及简便快捷等特点，被誉为下一代分子诊断技术。然而，其在实际应用中仍面临三大瓶颈：
(1) Cas酶工具有限，存在PAM序列限制、脱靶效应及不耐高温等问题；
(2) 核酸（DNA/RNA）一体化检测困难；
(3) 非核酸靶标（如蛋白、代谢物）检测难以实现。
为此，本团队围绕“新工具、新方法、新装备”三个层面开展研究，旨在拓展CRISPR技术的应用范围，提升其检测性能与可及性，最终实现从核酸到非核酸、从单靶标到多靶标、从实验室到现场（POCT）的分子诊断技术革新。
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2.1 新型Cas酶的筛选与开发
通过生物信息学分析现有Cas酶同源序列，利用细胞自主修复机制筛选新Cas酶。
2.2 Cas酶的定向进化与工程改造
噬菌体辅助定向进化：将目标蛋白与抑制系统融合表达于噬菌体，在进化过程中产生突变文库。活性提升的突变体可解除抑制，恢复噬菌体外壳蛋白表达并释放子代噬菌体，通过多轮筛选获得性能优化的Cas酶。
蛋白工程改造：识别关键氨基酸位点进行定点突变，显著提升编辑/检测效率与特异性，降低脱靶率。
2.3 Cas酶PAM特性全面评估系统
为扩大Cas酶的应用范围，特别是减少对PAM序列的依赖，开发了细胞外全面评估PAM的系统。该方法构建了一个在gRNA识别靶标前包含5个随机碱基（N）的PAM序列文库。当Cas酶-gRNA复合物识别并切割具有活性PAM的序列后，对切割产物加尾并进行二代测序，从而全面鉴定该酶所能识别的PAM序列谱。此方法不仅能验证已知PAM，还可能发现新的、更灵活的PAM选择，极大拓展了工具的适用范围。
从而自主开发了应用范围更广、特异性更强、活性更高的CRISPR/Cas新工具酶，真正实现了源头创新。
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3.1 检测方法迭代升级
CRISPR检测方法实现三步关键进化：
从两步法到一步法：扩增与检测反应在一管内完成
从一管式到一体化：真正实现"样本进-结果出"
从单重到多重：单管同步检测多靶标
时间缩短：从2小时降至<10分钟
这些进展使得检测能在单一恒温条件下完成，极大提高了可及性，为基层社区应用乃至居家自检提供了可能。
3.2 核酸标志物检测
3.2.1 SNP高特异检测（SPEAR方法）
开发NEAR与CRISPR结合的一体化检测方法（SPEAR），用于癌症早筛和伴随诊断。
技术原理：NEAR等温扩增与Cas12b切割活性整合，在单管内57℃恒温反应30分钟完成检测
性能优势：可检出0.1%低频突变（1000个野生型中检出1个突变），灵敏度优于Sanger测序（5-10%），与二代测序（NGS）相当，但成本更低、速度更快
应用场景：胰腺癌ctDNA热点突变检测、白血病耐药突变检测
3.2.2 miRNA定量检测
开发CRISPR-微流控联用技术，用于肝癌标志物miR-106a检测：
检测性能：灵敏度达pM级，10分钟内完成自动化定量
技术特点：无需核酸扩增，直接检测，避免扩增偏差
3.3多病原体同步检测
3.3.1 三重一体化检测系统
利用不同Cas酶的PAM偏好性和报告子切割特异性，实现单管三重检测：
技术方案：将不同的Cas酶（如Cas13a, Cas13b, Cas12a）与对应靶标的gRNA预混于同一反应体系中。每种Cas酶被激活后，会切割具有特定碱基偏好的报告子序列。通过对不同报告子标记不同的荧光基团，即可通过荧光信号区分并判断感染了何种病原体
检测性能：10分钟内完成三种病原体同步检测和可视化信号输出
应用实例：HPV16/18/其他高危型分型检测
3.3.2“红绿灯”逻辑判断策略
操作流程：样本加入→10分钟恒温孵育→肉眼或手机拍照判读结果
结果输出：红色/绿色荧光信号直观显示感染类型和耐药情况
防污染设计：全程闭管操作，避免气溶胶污染
3.4 幽门螺杆菌耐药位点鉴定
建立基于CRISPR的幽门螺杆菌克拉霉素和阿莫西林耐药突变检测方法：
样本类型：粪便样本、胃黏膜样本
性能数据：临床样本验证50例，效果优于PCR和一代测序，同时采用胃样本，耐药检出率达到100%
时间优势：30分钟内完成检测，传统培养法需3天
3.5 感染状态区分（SATCAS方法）
开发特异性RNA检测技术（SATCAS）区分HBV既往感染与近期感染：
技术原理：采用仅扩增RNA的等温扩增体系，不降解DNA模板，活病毒产生RNA信号，死亡病毒仅残留DNA
3.6 非核酸靶标：蛋白与代谢物检测
对于蛋白和代谢物等非核酸标志物，通过信号转导策略将靶标信号转换为可被CRISPR系统识别的核酸信号是关键。通过采用适配体（aptamer）替代抗体，利用其特异性捕获靶标蛋白（如肝癌标志物AFP）。捕获后，可直接对适配体序列进行检测，或通过构象变化触发后续核酸反应，最终利用CRISPR系统进行信号放大与输出。实验表明，该方法对AFP等蛋白的检测具有良好的线性关系。将CRISPR与适配体结合，还可将检测拓展至单细胞水平，通过靶向细胞表面特异性蛋白，实现单细胞的灵敏检测。
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4.1 极速PCR-微流控定量系统
4.1.1可视化DNA分子计数
利用毛细管微弱对流扩散效应固定扩增子位置，实现肉眼可见的DNA分子定量：
技术原理：DNA直径2.2-2.6 nm，在毛细管内扩增后形成固定荧光斑点，每个斑点对应单个DNA分子
检测性能：极速PCR仪3-5分钟完成扩增，实现可视化定量检测
局限性：高浓度样本时，光斑重叠，定量精度下降
4.1.2 微流控数字PCR平台
为了实现快速精准定量，自主搭建微流控平台，将样本分散至数百万个皮升级液滴：
技术优势：每个液滴独立反应，实现"相对降噪"，检测限达10 CFU/mL血液
绝对定量：实现核酸分子的定量检测
4.2 CRISPR-微流控集成芯片
为实现床旁检测（POCT），我们将扩增与CRISPR检测集成于同一微流控芯片，配合便携式装置，实现了“样本进，结果出”的闭环检测
技术集成：样本核酸提取、等温扩增、CRISPR检测全流程集成
防污染设计：全程闭管操作，避免开盖气溶胶污染
便携性：配套冻干试剂、便携装置和手机分析软件，适用于现场快速检测和资源有限地区。
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CRISPR技术作为一种共性检测技术平台，其科学意义在于通过源头工具创新，为分子诊断提供新原理；临床意义在于发展创新机制，实现对核酸、蛋白、代谢物等多类标志物的检测；产业意义在于建立创新模型，最终服务于临床健康指标检测与慢病管理。最终目标是让先进的诊断技术“飞入寻常百姓家”，通过提升技术的可及性，为人类健康管理提供普惠、精准的工具。
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